#4A. Phổ 1H: Số tín hiệu và tích phân tín hiệu

4A.1. Tương đương hóa học và tương đương từ

Về mặt lý thuyết NMR, với một từ trường Bo xác định, mọi proton sẽ có cùng tần số cộng hưởng. Trên thực tế, tần số cộng hưởng của các proton trong một phân tử không giống nhau mà là khác nhau tùy theo vị trí của proton trong phân tử. Nguồn gốc của sự khác nhau là do môi trường điện từ, thường gọi là môi trường phân tử, tại các vị trí khác nhau trong phân tử là khác nhau. Môi trường phân tử tại mỗi vị trí của phân tử sẽ bổ sung vào hay làm bớt đi độ lớn từ trường ngoài Bo, nên tần số cộng hưởng của proton tại ví trí đó sẽ lệch khỏi giá trị lý thuyết tính cho Bo.

Xét ví dụ phổ 1H NMR của methyl acetate. Trong phân tử chất này có 5 proton, chia làm 2 nhóm, ký hiệu Ha và Hb. Các proton trong cùng một nhóm có môi trường phân tử giống nhau, gọi là các proton tương đương hóa học. Tần số NMR của các proton tương đương hóa học là giống nhau. Các proton của các nhóm khác nhau có môi trường phân tử khác nhau, gọi là các proton không tương đương hóa học. Các proton ton không tương đương hóa học có tần số NMR khác nhau.     

Công thức cấu trúc của methyl acetate
5 proton chia thành 2 nhóm Ha và Hb.

Việc nhận biết các proton nào là tương đương hay không tương đương hóa học với nhau, từ đó xác định số vạch tín hiệu trên phổ 1H NMR được xem là một trong các kỹ năng cơ bản để phân tích phổ 1H NMR.

Trong các ví dụ dưới đây, mặc dù số proton trong mỗi phân tử là khác nhau, nhưng vì các proton đều là tương đương hóa học với nhau, nên phổ 1H NMR sẽ chỉ có duy nhất một tín hiệu.

Ví dụ phân tử với các proton tương đương hóa học

Cũng cần giải thích chi tiết hơn về trường hợp cyclohexane (hình cuối). Về nguyên tắc, các proton axial và proton equitorial có môi trường phân tử khác nhau, do vậy chúng là các proton không tương đương hóa học và sẽ có tần số NMR khác nhau. Dù vậy, trên thực tế, do các proton axial và equatorial luôn chuyển động thế chỗ nhau và vận tốc chuyển động nội phân tử này nhanh hơn nhiều lần so với quá trình xung trong kỹ thuật chụp phổ NMR, nên trên phổ 1H NMR chỉ ghi nhận được một giá trị trường phân tử trung bình chung cho cả 2 loại proton axial và equatorial, trừ khi đo phổ ở nhiệt độ rất thấp để hạn chế chuyển động nooijphaan tử. Hiện tượng này giống như khi ta chụp ảnh một chiếc xe đua đang chạy nhanh. Nếu không có máy ảnh đặc biệt cho phép chụp nhanh, chúng ta sẽ chỉ nhận được một bức ảnh loáng loáng nhòe.

Dưới đây là một vài ví dụ về phân tử với 2 hệ spin không tương đương nhau,giống như trường hợp methyl acetate nói tới ở phần đầu.

Ví dụ phân tử với 2 hệ proton không tương đương hóa học

Các phân tử trong sinh học, như peptide, DNA, protein, lipid, ... thường có cấu trúc phức tạp và tính đối xứng thấp, do vậy các proton thương không đương nhau, như ví dụ nêu ở hình dưới đây.

Ví dụ các phân tử với các proton không tương đương trong sinh học

Với các phân tử không quá phức tạp, có thể nhận biết các proton là tương đương hay không tương đương hóa học dựa trên tính đối xứng trực quan ngay từ công thức cấu trúc. Với các phân tử phức tạp, việc nhận biết phải dựa trên các quy tắc hóa học lập thể và có thể khá rắc rối. Có một quy tắc chung là các proton ở các phía khác nhau của các mạch vòng không đối xứng hay các nối đôi thường không tương đương hóa học. Như trường hợp alkene và cyclohexene minh họa dưới đây, các proton Ha là trans, trong khi các proton Hb là cis.

Proton không tương đương hóa học trong nối đôi và vòng bất xứng.

Ngoài khái niệm tương đương hóa học nói trên, trong phổ NMR còn có khái niệm tương đương "chặt" hơn, gọi là tương đương từ (magnetic equivalence). Các proton là đương đương hóa học với nhau sẽ có cùng một giá trị tần số NMR và do đó tín hiệu NMR sẽ trùng vào nhau. Các proton là tương đương từ với nhau cũng có tính chất như trên. Sự khác nhau chỉ thể hiện khi xét tới tương tác của các proton tương đương với một hạt nhân khác, không tương đương với chúng. Tương tác này dẫn tới hiện tượng tách vạch, sẽ nói tới ở #7. Các proton tương đương từ sẽ tương tác như nhau, trong khi các proton tương tác hóa học sẽ tương tác một cách khác nhau với proton không tương đương với chúng.

Hai ví dụ đơn giản dưới đây sẽ minh họa cho trường hợp tương đương hóa học và tương đương từ. Trường hợp hình bên trái, 2 proton vừa tương đương hóa học, vừa tương đương từ.; Chúng tương tác như nhau với hạt nhân Flo (F). Hai proton ở hình bên phải là tương đương hóa học, nhưng không tương đương từ; Chúng tương tác với mỗi hạt nhân F một cách khác nhau. Ngược lại, hai hạt nhân F cũng là tương đương hóa học, nhưng cũng không tương đương từ; Chúng tương tác với 2 proton một cách khác nhau.

Minh họa tương đương hóa học và tương đương từ

Cũng cần lưu ý rằng, về mặt nguyên tắc, những điều phân tích trên về tương đương hóa học đối với proton cũng có thể áp dụng với các hạt nhân khác, như trường hợp Flo ở ví dụ trên, dù rằng rất ít khi gặp trong phân tích phổ NMR nói chung.

4A.2. Số tín hiệu 1H NMR

Phổ 1H NMR có dạng các tín hiệu cộng hưởng hay còn gọi là các vạch, mũi, píc cộng hưởng trên thang tần số tính theo ppm. Vì các proton tương đương hóa học có cùng tần số cộng hưởng nên tín hiệu của chúng sẽ trùng lên nhau, tạo thành một tín hiệu duy nhất. Như vậy, nếu phân tử có n nhóm proton tương đương hóa học khác nhau thì phổ 1H NMR của phân tử sẽ có n tín hiệu.

Trong ví dụ minh họa đơn giản dưới đây, phân tử có tất cả 10 proton. Do tính đối xứng cao nên 10 proton này chia thành 02 nhóm, ký hiệu Ha và Hb. Phổ 1H NMR sẽ gồm 02 tín hiệu, tương ứng với các proton Ha và Hb.

Minh họa xác định số tín hiệu trên phổ 1H NMR

5.3. Tích phân phổ 1H NMR

Trên phổ 1H NMR, mỗi tín hiệu đặc trưng cho một proton hay một nhóm proton tương đương hóa học. Cường độ của mỗi tín hiệu 1H NMR tỷ lệ với số proton tham gia vào tín hiệu này. Đây là điểu rất khác biệt của phổ NMR so với hầu hết các dạng phổ khác. Chúng ta không thể nhận được các thông tin định lượng dựa vào cường độ vạch phổ UV hay phổ FT IR. Giá trị cường độ tín hiệu NMR được xác định bằng diện tích phần bao bởi tín hiệu và đường nền nằm ngang, do vậy còn gọi là giá trị tích phân.

Trở lại ví dụ đã xét ở phần trên với phân tử có 10 proton, chia thành 2 nhóm Ha và Hb. Giá trị tích phân của hai tín hiệu Hb và Ha đo được trên phổ tương ứng là 1,0 và 1,5. Số proton của hai nhóm Hb và Ha là 4 và 6, đúng theo tỷ lệ 1,0/1,5. Trong trường hợp đơn giản này, chúng ta dễ dàng suy ra giá trị tích phân đúng của Hb là 4 và của Ha là 6, đúng với số proton của mỗi nhóm proton tương đương. Trong trường hợp tổng quát, cách hiệu chỉnh giá trị tích phân bao gồm 4 bước như sau:

1. Tính tổng tích phân đo trực tiếp. Tính cho ví dụ trên là 1,0 + 1,5 = 2,5.
2. Đếm số proton trong phân tử. Tính cho ví dụ trên là 4 + 6 = 10.
3. Tính giá trị tích phân ứng với 1 proton. Tính cho ví dụ trên là 2,5 : 10 = 0,25.
4. Tính lại (hiệu chỉnh) giá trị tích phân cho từng tín hiệu. Tính cho ví dụ trên, giá trị tích phân đúng cho tín hiệu Hb là: 1,0 : 0,25 = 4,0; cho tín hiệu Ha là: 1,5 : 0,25 = 6,0.

     

Tích phân tín hiệu 1H NMR

Trong ví dụ dưới đây với phổ 1H NMR của C9H10O2, giá trị tích phân thực nghiệm không "đẹp" như ví dụ trên. Bạn đọc có thể tự tính số proton ứng với mỗi tín hiệu A, B và C theo quy tắc 4 bước nêu trên.

Có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng tới độ chính xác của giá trị tích phân tín hiệu phổ 1H NMR. Dưới đây là một số nguyên nhân gây sai số tích phân thường gặp phải:

• Do nhiễu và tạp chất ở lân cận vùng xác định tích phân.
• Do có sự chồng chập chân phổ giữa các tín hiệu liền kề nhau.
• Do thời gian hồi phục của các proton quá khác nhau.
• Do các tín hiệu phụ, liên quan tới quá trình quay mẫu. 
• Do một số nguyên nhân kỹ thuật khác.

Nói chung, sai số tích phân của phổ 1H NMR đến vài phần trăm là chấp nhận được. Trong ví dụ minh họa dưới đây, sai số tích phân cực đại thuộc về tín hiệu ở 1,3ppm, tương ứng với 03 proton, sai số cỡ 5%.

Sai số tích phân phổ 1H NMR. Giá trị tích phân đã hiệu chỉnh in bên dưới 8 tín hiệu.