Trong phần này, NMRHanoi sẽ trình bày một số ví dụ giải phổ NMR ở mức độ tương đối cao, chủ yếu dành cho các bạn đã, đang và sẽ thực sự làm việc (học tập, nghiên cứu, ...) trong các lĩnh vực có sử dụng đến NMR.
8C.1. Gán phổ NMR mẫu Thymidine
1. Dữ liệu thực nghiệm (sẽ cho chi tiết ở phần 2. Giải phổ)
- Phổ 1H NMR
- Phổ 13C NMR
- Phổ DEPTs
- Phổ COSY
- Phổ HSQC
- Phổ HMBC
- Công thức cấu trúc Thymidine
2. Giải phổ (gán phổ)
- Phân tích phổ 1H NMR
Phổ 1H NMR, mẫu Thymidine
Trên phổ 1H NMR mẫu Thymidine, ngoài tín hiệu dung môi và nước, chúng ta có thể gán được chắc chắn 03 tín hiệu sau:
- Methyl H3 (3H - d - 1,77ppm - 1,2Hz) căn cứ giá trị tích phân (3H) duy nhất trên phổ, CS vùng trường cao và hằng số tích phân ứng với tương tác xa.
- Methylene H4 (1H - q - 7,69ppm - 1,2Hz) căn cứ giá trị CS đặc thù của proton duy nhất trong vòng, hằng số tương tác bằng với hằng số tương tác của proton cách 4 liên kết đã gán (H3) và dạng vạch bội quartet do tương tác với CH3 (H3).
- H6 (1H - s - 11,26ppm) là tín hiệu vạch đơn (singlet) duy nhất trong phân tử, với giá trị CS nằm ở phía trường rất thấp, đặc thù cho NH.
Tổng hợp kết quả gán sơ bộ như sau:
Kết quả gán phổ 1H NMR mẫu Thymidine
Các tín hiệu còn lại mặc dù khá rõ ràng, có thể cố gán dựa trên giá trị CS, tích phân và vạch bội, nhưng tốt nhất là gán dựa trên dữ liệu phổ COSY trong phần tiếp sau, dễ dàng và chắc chắn hơn.
- Phân tích phổ COSY
Phổ COSY mẫu Thymidine
Phổ COSY cho thông tin về liên kết H-H, thường là 3JHH (như liên kết H7-H8), hãn hữu có thể có 4JHH (như liên kết H3-H4). Trên phổ, khi nối các tín hiệu đường chéo và các tín hiệu giao nhau của một cặp liên kết, ta sẽ được một hình vuông.
Để phân tích phổ COSY, tốt nhất ta nên lập bảng gán COSY, bao gồm số liên kết COSY H-H cho mỗi tín hiệu. Để xác định số liên kết COSY liên quan tới một tín hiệu trên đường chéo, đơn giản chúng ta đếm số hình vuông có đỉnh là tín hiệu trên đường chéo đang xét.
Báng gán phổ COSY mẫu Thymidine
Trên bảng, ngoài các liên kết 3JHH là chủ yếu, còn có trường hợp đặc biệt là liên kết xa 4JHH, ký hiệu * (liên kết H3-H4).
Trên bảng gán phổ COSY, ngoài 03 tín hiệu đã gán được từ phổ 1H NMR, còn lại có 5 tín hiệu có 01 liên kết, 03 tín hiệu có 02 liên kết và duy nhất tín hiệu 4,23ppm có 03 liên kết.
Xét trên công thức cấu trúc Trymidicine, chỉ có duy nhất H9 có 03 liên kết 3JHH (H9-H8; H9-H10 và H9-H11), do vậy tín hiệu 4,23ppm được gán cho H9.
Trong 03 nhóm proton có liên kết với H9, chỉ có H8 có giá trị tích phân bằng 2 (nhóm CH2), do vậy dễ dàng gán tín hiệu 2,07 (2H) là H8. Hai liên kết còn lại sẽ là H10 và H11. Lưu ý rằng H10 có 01 liên kết 3JHH còn H11 có 02 liên kết 3JHH, căn cứ vào bảng gán COSY, dễ dàng gán H10 cho tín hiệu 5,21ppm còn H11 là 3,75ppm.
H8 có liên kết với H9 trong phân tích trên. Liên kết còn lại là H8-H7, cho phép gán tín hiệu 6,16ppm cho H7. Thêm nữa, có thể thấy tín hiệu 6,16 là vạch bội, triplet, do tương tác với 2 proton của CH2 (H8).
Chỉ còn lại 02 vị trí H12 và H13. Dựa vào giá trị tích phân dễ dàng gán tín hiệu 3,56ppm thuộc về H12 (2H) và tín hiệu 4,99ppm là H13 (1H), hoàn thiện bức tranh 1H của Thymidine như hình dưới đây..
Tông hợp kết quả gán 1H mẫu Thymidine.
- Phân tích phổ 13C NMR và bộ phổ DEPTs
Phổ 13C NMR mẫu Thymidine
Bộ phổ DEPTs, mẫu Thymidine
Không kể tín hiệu dung môi (DMSO), trên phổ 13C NMR có 09 tín hiệu C, thiếu 01 tín hiệu so với công thức phân tử. Tín hiệu thứ 10 có thể trùng với một trong các tín hiệu đã đếm, hoặc trùng với tín hiệu dung môi. Giãn phổ tín hiệu dung môi phát hiện ra tín hiệu C thứ 10 trùng trong đó.
Ngoài tín hiệu 12,25ppm dễ dàng gán cho C3, các tín hiệu còn lại nên kết hợp với phổ 2D NMR ở phần sau để gán thì sẽ chắc chắn và dễ dàng hơn.
- Phân tích phổ HSQC
Phổ HSQC, mẫu Thimidine
Phổ HSQC cho ta thông tin về các liên kết trực tiếp 1JCH. Việc phân tích phổ HSQC sẽ rất dễ dàng và quan trọng khi đã gán được tốt phổ 1H NMR và phổ COSY. Theo công thức phân tử Thymidine, trong số 10 cụm tín hiệu proton, có 07 cụm CHn, còn lại 02 x OH và 01 x NH, như vậy nhờ phổ HSQC chúng ta có thể gán được ngay 07 vị trí C có liên kết trực tiếp 1JCH, tức là 07 cụm CHn.
Chúng ta có thể quay lại phổ DEPTs để kiểm chứng các kết quả gán HSQC. Đặc biệt, ngày nay đã có phổ Edited HSQC, là phổ ghép DEPTs + HSQC, nhờ đó có thể kiểm chứng ngay trên phổ Edited HSQC.
Chỉ còn lại 03 tín hiệu C bậc 4, phải chờ phân tich phổ HMBC.
- Phân tích phổ HMBC
Phổ HMBC, mẫu Thymidine
Giãn phổ HMBC mẫu Thymidine
Phổ HMBC cho thông tin về liên kết xa nJCH, với n = 2, 3, ... Phổ HMBC đóng vai trò quan trọng để gán các C bậc 4, vốn không gán được trên phổ HSQC, và để kết nối các cụm, các mảnh thành phân tử hoàn chỉnh. Tổng hợp kết quả phân tích HMBC vừa để hoàn thiện cấu trúc, vừa để kiểm chứng các kết quả gán HSQC (hình trên).
Để gán các C bậc 4, có thể lập bảng tổng hợp liên kết dựa trên công thức phân tử của Thymidine để dễ phân tích.
Bảng tổng hợp liên kết C bậc 4 mẫu Thymidicine
Dựa vào bảng trên, dễ dàng gán các tín hiệu C ở 109,36 - 150,47 và 163,74ppm tương ứng là C2, C5 và C1.
3. Nhận xét
- abc
- Phổ 1H NMR
- Phổ 13C NMR
- Phổ DEPTs
- Phổ COSY
- Phổ HSQC
- Phổ HMBC
- Công thức cấu trúc Thymidine
- Phân tích phổ 1H NMR
 |
| Phổ 1H NMR, mẫu Thymidine |
- Methyl H3 (3H - d - 1,77ppm - 1,2Hz) căn cứ giá trị tích phân (3H) duy nhất trên phổ, CS vùng trường cao và hằng số tích phân ứng với tương tác xa.
- Methylene H4 (1H - q - 7,69ppm - 1,2Hz) căn cứ giá trị CS đặc thù của proton duy nhất trong vòng, hằng số tương tác bằng với hằng số tương tác của proton cách 4 liên kết đã gán (H3) và dạng vạch bội quartet do tương tác với CH3 (H3).
- H6 (1H - s - 11,26ppm) là tín hiệu vạch đơn (singlet) duy nhất trong phân tử, với giá trị CS nằm ở phía trường rất thấp, đặc thù cho NH.
Tổng hợp kết quả gán sơ bộ như sau:
 |
| Kết quả gán phổ 1H NMR mẫu Thymidine |
Các tín hiệu còn lại mặc dù khá rõ ràng, có thể cố gán dựa trên giá trị CS, tích phân và vạch bội, nhưng tốt nhất là gán dựa trên dữ liệu phổ COSY trong phần tiếp sau, dễ dàng và chắc chắn hơn.
- Phân tích phổ COSY
 |
| Phổ COSY mẫu Thymidine |
Để phân tích phổ COSY, tốt nhất ta nên lập bảng gán COSY, bao gồm số liên kết COSY H-H cho mỗi tín hiệu. Để xác định số liên kết COSY liên quan tới một tín hiệu trên đường chéo, đơn giản chúng ta đếm số hình vuông có đỉnh là tín hiệu trên đường chéo đang xét.
 |
| Báng gán phổ COSY mẫu Thymidine |
Trên bảng gán phổ COSY, ngoài 03 tín hiệu đã gán được từ phổ 1H NMR, còn lại có 5 tín hiệu có 01 liên kết, 03 tín hiệu có 02 liên kết và duy nhất tín hiệu 4,23ppm có 03 liên kết.
Xét trên công thức cấu trúc Trymidicine, chỉ có duy nhất H9 có 03 liên kết 3JHH (H9-H8; H9-H10 và H9-H11), do vậy tín hiệu 4,23ppm được gán cho H9.
Trong 03 nhóm proton có liên kết với H9, chỉ có H8 có giá trị tích phân bằng 2 (nhóm CH2), do vậy dễ dàng gán tín hiệu 2,07 (2H) là H8. Hai liên kết còn lại sẽ là H10 và H11. Lưu ý rằng H10 có 01 liên kết 3JHH còn H11 có 02 liên kết 3JHH, căn cứ vào bảng gán COSY, dễ dàng gán H10 cho tín hiệu 5,21ppm còn H11 là 3,75ppm.
H8 có liên kết với H9 trong phân tích trên. Liên kết còn lại là H8-H7, cho phép gán tín hiệu 6,16ppm cho H7. Thêm nữa, có thể thấy tín hiệu 6,16 là vạch bội, triplet, do tương tác với 2 proton của CH2 (H8).
Chỉ còn lại 02 vị trí H12 và H13. Dựa vào giá trị tích phân dễ dàng gán tín hiệu 3,56ppm thuộc về H12 (2H) và tín hiệu 4,99ppm là H13 (1H), hoàn thiện bức tranh 1H của Thymidine như hình dưới đây..
 |
| Tông hợp kết quả gán 1H mẫu Thymidine. |
- Phân tích phổ 13C NMR và bộ phổ DEPTs
 |
| Phổ 13C NMR mẫu Thymidine |
 |
| Bộ phổ DEPTs, mẫu Thymidine |
Không kể tín hiệu dung môi (DMSO), trên phổ 13C NMR có 09 tín hiệu C, thiếu 01 tín hiệu so với công thức phân tử. Tín hiệu thứ 10 có thể trùng với một trong các tín hiệu đã đếm, hoặc trùng với tín hiệu dung môi. Giãn phổ tín hiệu dung môi phát hiện ra tín hiệu C thứ 10 trùng trong đó.
Ngoài tín hiệu 12,25ppm dễ dàng gán cho C3, các tín hiệu còn lại nên kết hợp với phổ 2D NMR ở phần sau để gán thì sẽ chắc chắn và dễ dàng hơn.
- Phân tích phổ HSQC
 |
| Phổ HSQC, mẫu Thimidine |
Chúng ta có thể quay lại phổ DEPTs để kiểm chứng các kết quả gán HSQC. Đặc biệt, ngày nay đã có phổ Edited HSQC, là phổ ghép DEPTs + HSQC, nhờ đó có thể kiểm chứng ngay trên phổ Edited HSQC.
Chỉ còn lại 03 tín hiệu C bậc 4, phải chờ phân tich phổ HMBC.
- Phân tích phổ HMBC
 |
| Phổ HMBC, mẫu Thymidine |
 |
| Giãn phổ HMBC mẫu Thymidine |
Phổ HMBC cho thông tin về liên kết xa nJCH, với n = 2, 3, ... Phổ HMBC đóng vai trò quan trọng để gán các C bậc 4, vốn không gán được trên phổ HSQC, và để kết nối các cụm, các mảnh thành phân tử hoàn chỉnh. Tổng hợp kết quả phân tích HMBC vừa để hoàn thiện cấu trúc, vừa để kiểm chứng các kết quả gán HSQC (hình trên).
Để gán các C bậc 4, có thể lập bảng tổng hợp liên kết dựa trên công thức phân tử của Thymidine để dễ phân tích.
 |
| Bảng tổng hợp liên kết C bậc 4 mẫu Thymidicine |
- abc
8C.2. Gán dữ liệu NMR mẫu Artemisinin
- Dữ liệu thực nghiệm (xem dữ liệu phổ chi tiết ở phần giải phổ):
- Phổ 1H NMR.
- Phổ 13C NMR, DEPT
- Phổ HSQC
- Phổ COSY
- Phổ HMBC
- Hợp chất cần gán phổ: Artemisinine - C15H22O5.
Công thức phân tử của Artemisinine
- Dữ liệu thực nghiệm (xem dữ liệu phổ chi tiết ở phần giải phổ):
- Phổ 13C NMR, DEPT
- Phổ HSQC
- Phổ COSY
- Phổ HMBC
- Hợp chất cần gán phổ: Artemisinine - C15H22O5.
 |
| Công thức phân tử của Artemisinine |
- Giải phổ:
- Giải phổ:
Bước 1: Phân tích phổ 1H NMR.
Phổ 1H NMR mẫu Artemisinine
Giãn phổ 1H NMR mẫu Artemisinine
- Căn cứ vào giá trị CS, dạng vạch bội và giá trị tích phân, có thể thấy dễ dàng gán được 03 tín hiệu của 03 nhóm CH3, trong đó có 01 tín hiệu vạch đơn (s) của H15 và hai tín hiệu vạch kép (d) của H13 và H14.
- Các tín hiệu vùng 1-2ppm bị chồng chập mạnh, khó gán theo phổ 1H NMR. Đây là vùng tín hiệu của các methil và methylene trong vòng. Để gán được các vị trí này, sẽ cần đến phổ 2D NMR ở các bước sau.
- Căn cứ vào giá trị CS, dạng vạch bội và giá trị tích phân cũng dễ dàng xác định 02 tín hiệu vùng khử che chắn ở phía trường thấp là H5 (s, che chắn rất mạnh do liền với 2O) và H11 (dq, che chắn mạnh do kề với C= O).
- Có thể gán cặp tín hiệu của 02 proton không tương đương của cùng một gốc CH2 (H3).
Tổng hợp kết quả gán sơ bộ phổ 1H NMR như sau:
Bước 2: Phân tích phổ 13C NMR và DEPTs.
Phổ 13C NMR mẫu Artemisinine
Giãn phổ 13C NMR mẫu Artemisinine
Phổ 13C NMR có độ phân giải tốt, trên đó có thể thấy:
- Đủ 15 tín hiệu của 15C, ngoài tín hiệu dung môi (sao xanh).
- Có thể dự đoán 03 tín hiệu có biên độ thấp ở vùng trường thấp là của 03C bậc 4 (C4-C6-C12). Nhận định này sẽ được khẳng định chắc chắn khi phân tích thêm phổ DEPTs.
Phổ DEPT 135 mẫu Artemisinine
Giãn phổ DEPT 135 mẫu Artemisinine
Phân tích phổ DEPTs cho phép khẳng định:
- Các tín hiệu C bậc 4, chỉ có mặt trên phổ 13C NMR, không có trên phổ DEPTs (C4-C6-C12).
- Phân biệt CH2 (tín hiệu quay xuống) với CH và CH3 (tín hiệu quay lên). Căn cứ vào phổ DEPT 90, có thể phân biệt tiếp CH với CH3, dù vậy việc này sẽ dễ dàng hơn khi phân tích phổ HSQC ở bước sau.
Kết quả gán sơ bộ 15 tín hiệu của phổ 13C NMR và DEPTs như sau:
Bước 3: Phân tích phổ HSQC
Phổ HSQC mẫu Artemisinine
Giãn phổ HSQC mẫu Artemisinine
- Phổ Dept-HSQC cho thông tin về liên kết trực tiếp 1JCH và phân biệt CH2 với CH và CH3. Trên phổ dễ dàng gán 04 cặp tín hiệu CH2 bất đối xứng (màu xanh lá, khoanh vòng đỏ).
- Phân tử Artemisinine có 05 x CH + 04 x CH2 + 03 x CH3, tổng số là 12 tín hiệu 1JCH. Lưu ý rằng, do 04 vị trí CH2 trong phân tử đều bất đối xứng, các proton là không đương đương, mỗi vị trí CH2 cho 02 tín hiệu 1JCH, nên số tín hiệu sẽ là 5 + (4 x 2) + 3 = 16. Phổ HSQC trên hình có độ phân giải tương đối tốt, phân biệt được đủ 16 tín hiệu, trong đó chỉ có 02 tín hiệu 24,9-1,47ppm và 25,2-1,45 bị chồng chập một phần.
- Do thang đo CS theo trục carbon (C) rộng gấp khoảng 10 lần so với thang đo CS của proton (1H) nên khi các tín hiệu 1H NMR được "chiếu" lên trục C sẽ cải thiện độ phân giải đáng kể, giúp khắc phục hiện tượng chồng chập vạch ở vùng 1-2ppm. Do đó so với kết quả phân tích phổ 1H NMR ở bước 1, nhờ phân tích phổ HSQC, số cụm H được gán đã tăng từ 6 lên 12 cụm, tương ứng với toàn bộ 22H của phân tử.
Kết quả gán sơ bộ 16 tín hiệu 1JCH trên phổ HSQC như sau:
Bước 4: Phân tích phổ COSY
Phổ COSY, mẫu Artemisinine
Giãn phổ COSY, mẫu Artemisinine
Vai trò, ý nghĩa chính của phân tích phổ COSY là kiểm chứng và nới rộng các kết quả gán phổ 1H NMR, tạo nên các cụm liên kết, các mảnh phân tử thay vì chỉ gán được từng nhóm proton tương đương riêng rẽ. Vì thế, phổ COSY sẽ chỉ ra các proton cô lập, không tương tác (H5, H15) và ghép nối các cụm liên kết qua 3JHH, như H7-H11-H13, H3a-H3b-H2a-H2b.
Kết quả gán sơ bộ phổ COSY như sau:
Bước 5: Phân tích phổ HMBC
Phổ HMBC, mẫu Artemisinine
Giãn phổ HMBC, mẫu Artemisinine
HMBC cho thông tin về liên kết xa 2JCH, 3JCH, nhờ đó có thể "khâu" các miểng 1JCH đã gán trước đó theo phổ HSQC. Thường thì khó khăn chính của bước này là không phân biệt được một liên kết là 2JCH hay 3JCH. Vì thế, khi phân tích phổ HMBC, thường phải kết hợp với phân tích phổ COSY. Ví dụ: Ba tín hiệu HMBC 50,1ppm (C1), 37,5ppm (C10) và 33,6ppm (C9) đều có liên kết với proton ở 1,0ppm (H14), suy ra trật tự C1, C9 và C10, nếu là liên kết 2JHC và 3JHC. Nhưng kết quả phân tích phổ COSY cho thấy có liên kết 3JHH giữa H14 và H10 (1,42ppm), còn theo kết quả phân tích phổ HSQC thì H10 (1,42ppm) lại có liên kết 1JHC với tín hiệu C ở 37,5ppm. Như vậy, 37,7 phải là C10 có liên kết 2JCH và 50,1ppm và 33,6ppm tương ứng phải là C1 hoặc C9 qua 3JCH.
Điểm lưu ý nữa của phổ HMBC là cho phép gán các C bậc 4, điều mà không thể thực hiện được với phổ COSY. Ví dụ: C bậc 4 ở 105,4ppm (C4) có liên kết với proton H15 (s; 1,45ppm), nhờ đó có thể gán C này là C4 (qua 2JCH). C bậc 4 thứ 2 là C12 (172,1ppm) liên kết đồng thời với H13 (1,21ppm) và H5 (5,86ppm), nhờ đó có thể gán C12, có 3JCH tới cả hai hydrogen.
Kết quả gán phổ HMBC, mẫu Artemisinine:
- Nhận xét
- Đây là bài toán gán phổ điển hình. Artemisinine là phân tử có kích thước trung bình (MW=282Da), cấu trúc không quá phức tạp nhưng cũng không đơn giản. Bộ phổ NMR gồm 1H-13C-Depts-HSQC-COSY-HMBC, tương đối điển hình cho bài toán gán phổ. Đối với các phân tử có cấu hình không gian tương đối phức tạp, thường cần bổ sung phổ liên kết không gian như NOESY hay ROESY.
- Các
Bước 1: Phân tích phổ 1H NMR.
 |
| Phổ 1H NMR mẫu Artemisinine |
 |
| Giãn phổ 1H NMR mẫu Artemisinine |
- Căn cứ vào giá trị CS, dạng vạch bội và giá trị tích phân, có thể thấy dễ dàng gán được 03 tín hiệu của 03 nhóm CH3, trong đó có 01 tín hiệu vạch đơn (s) của H15 và hai tín hiệu vạch kép (d) của H13 và H14.
- Các tín hiệu vùng 1-2ppm bị chồng chập mạnh, khó gán theo phổ 1H NMR. Đây là vùng tín hiệu của các methil và methylene trong vòng. Để gán được các vị trí này, sẽ cần đến phổ 2D NMR ở các bước sau.
- Căn cứ vào giá trị CS, dạng vạch bội và giá trị tích phân cũng dễ dàng xác định 02 tín hiệu vùng khử che chắn ở phía trường thấp là H5 (s, che chắn rất mạnh do liền với 2O) và H11 (dq, che chắn mạnh do kề với C= O).
- Có thể gán cặp tín hiệu của 02 proton không tương đương của cùng một gốc CH2 (H3).
Bước 2: Phân tích phổ 13C NMR và DEPTs.
Phổ 13C NMR có độ phân giải tốt, trên đó có thể thấy:
Phân tích phổ DEPTs cho phép khẳng định:
Bước 3: Phân tích phổ HSQC
Kết quả gán sơ bộ 16 tín hiệu 1JCH trên phổ HSQC như sau:
Bước 4: Phân tích phổ COSY
Vai trò, ý nghĩa chính của phân tích phổ COSY là kiểm chứng và nới rộng các kết quả gán phổ 1H NMR, tạo nên các cụm liên kết, các mảnh phân tử thay vì chỉ gán được từng nhóm proton tương đương riêng rẽ. Vì thế, phổ COSY sẽ chỉ ra các proton cô lập, không tương tác (H5, H15) và ghép nối các cụm liên kết qua 3JHH, như H7-H11-H13, H3a-H3b-H2a-H2b.
Kết quả gán sơ bộ phổ COSY như sau:
Bước 5: Phân tích phổ HMBC
HMBC cho thông tin về liên kết xa 2JCH, 3JCH, nhờ đó có thể "khâu" các miểng 1JCH đã gán trước đó theo phổ HSQC. Thường thì khó khăn chính của bước này là không phân biệt được một liên kết là 2JCH hay 3JCH. Vì thế, khi phân tích phổ HMBC, thường phải kết hợp với phân tích phổ COSY. Ví dụ: Ba tín hiệu HMBC 50,1ppm (C1), 37,5ppm (C10) và 33,6ppm (C9) đều có liên kết với proton ở 1,0ppm (H14), suy ra trật tự C1, C9 và C10, nếu là liên kết 2JHC và 3JHC. Nhưng kết quả phân tích phổ COSY cho thấy có liên kết 3JHH giữa H14 và H10 (1,42ppm), còn theo kết quả phân tích phổ HSQC thì H10 (1,42ppm) lại có liên kết 1JHC với tín hiệu C ở 37,5ppm. Như vậy, 37,7 phải là C10 có liên kết 2JCH và 50,1ppm và 33,6ppm tương ứng phải là C1 hoặc C9 qua 3JCH.
Điểm lưu ý nữa của phổ HMBC là cho phép gán các C bậc 4, điều mà không thể thực hiện được với phổ COSY. Ví dụ: C bậc 4 ở 105,4ppm (C4) có liên kết với proton H15 (s; 1,45ppm), nhờ đó có thể gán C này là C4 (qua 2JCH). C bậc 4 thứ 2 là C12 (172,1ppm) liên kết đồng thời với H13 (1,21ppm) và H5 (5,86ppm), nhờ đó có thể gán C12, có 3JCH tới cả hai hydrogen.
Kết quả gán phổ HMBC, mẫu Artemisinine:
 |
| Phổ 13C NMR mẫu Artemisinine |
 |
| Giãn phổ 13C NMR mẫu Artemisinine |
Phổ 13C NMR có độ phân giải tốt, trên đó có thể thấy:
- Đủ 15 tín hiệu của 15C, ngoài tín hiệu dung môi (sao xanh).
- Có thể dự đoán 03 tín hiệu có biên độ thấp ở vùng trường thấp là của 03C bậc 4 (C4-C6-C12). Nhận định này sẽ được khẳng định chắc chắn khi phân tích thêm phổ DEPTs.
 |
| Phổ DEPT 135 mẫu Artemisinine |
 |
| Giãn phổ DEPT 135 mẫu Artemisinine |
- Các tín hiệu C bậc 4, chỉ có mặt trên phổ 13C NMR, không có trên phổ DEPTs (C4-C6-C12).
- Phân biệt CH2 (tín hiệu quay xuống) với CH và CH3 (tín hiệu quay lên). Căn cứ vào phổ DEPT 90, có thể phân biệt tiếp CH với CH3, dù vậy việc này sẽ dễ dàng hơn khi phân tích phổ HSQC ở bước sau.
Kết quả gán sơ bộ 15 tín hiệu của phổ 13C NMR và DEPTs như sau:
Bước 3: Phân tích phổ HSQC
 |
| Phổ HSQC mẫu Artemisinine |
 |
| Giãn phổ HSQC mẫu Artemisinine |
- Phổ Dept-HSQC cho thông tin về liên kết trực tiếp 1JCH và phân biệt CH2 với CH và CH3. Trên phổ dễ dàng gán 04 cặp tín hiệu CH2 bất đối xứng (màu xanh lá, khoanh vòng đỏ).
- Phân tử Artemisinine có 05 x CH + 04 x CH2 + 03 x CH3, tổng số là 12 tín hiệu 1JCH. Lưu ý rằng, do 04 vị trí CH2 trong phân tử đều bất đối xứng, các proton là không đương đương, mỗi vị trí CH2 cho 02 tín hiệu 1JCH, nên số tín hiệu sẽ là 5 + (4 x 2) + 3 = 16. Phổ HSQC trên hình có độ phân giải tương đối tốt, phân biệt được đủ 16 tín hiệu, trong đó chỉ có 02 tín hiệu 24,9-1,47ppm và 25,2-1,45 bị chồng chập một phần.
- Do thang đo CS theo trục carbon (C) rộng gấp khoảng 10 lần so với thang đo CS của proton (1H) nên khi các tín hiệu 1H NMR được "chiếu" lên trục C sẽ cải thiện độ phân giải đáng kể, giúp khắc phục hiện tượng chồng chập vạch ở vùng 1-2ppm. Do đó so với kết quả phân tích phổ 1H NMR ở bước 1, nhờ phân tích phổ HSQC, số cụm H được gán đã tăng từ 6 lên 12 cụm, tương ứng với toàn bộ 22H của phân tử.
Kết quả gán sơ bộ 16 tín hiệu 1JCH trên phổ HSQC như sau:
Bước 4: Phân tích phổ COSY
 |
| Phổ COSY, mẫu Artemisinine |
 |
| Giãn phổ COSY, mẫu Artemisinine |
Vai trò, ý nghĩa chính của phân tích phổ COSY là kiểm chứng và nới rộng các kết quả gán phổ 1H NMR, tạo nên các cụm liên kết, các mảnh phân tử thay vì chỉ gán được từng nhóm proton tương đương riêng rẽ. Vì thế, phổ COSY sẽ chỉ ra các proton cô lập, không tương tác (H5, H15) và ghép nối các cụm liên kết qua 3JHH, như H7-H11-H13, H3a-H3b-H2a-H2b.
Kết quả gán sơ bộ phổ COSY như sau:
Bước 5: Phân tích phổ HMBC
 |
| Phổ HMBC, mẫu Artemisinine |
 |
| Giãn phổ HMBC, mẫu Artemisinine |
Điểm lưu ý nữa của phổ HMBC là cho phép gán các C bậc 4, điều mà không thể thực hiện được với phổ COSY. Ví dụ: C bậc 4 ở 105,4ppm (C4) có liên kết với proton H15 (s; 1,45ppm), nhờ đó có thể gán C này là C4 (qua 2JCH). C bậc 4 thứ 2 là C12 (172,1ppm) liên kết đồng thời với H13 (1,21ppm) và H5 (5,86ppm), nhờ đó có thể gán C12, có 3JCH tới cả hai hydrogen.
Kết quả gán phổ HMBC, mẫu Artemisinine:
- Nhận xét
- Đây là bài toán gán phổ điển hình. Artemisinine là phân tử có kích thước trung bình (MW=282Da), cấu trúc không quá phức tạp nhưng cũng không đơn giản. Bộ phổ NMR gồm 1H-13C-Depts-HSQC-COSY-HMBC, tương đối điển hình cho bài toán gán phổ. Đối với các phân tử có cấu hình không gian tương đối phức tạp, thường cần bổ sung phổ liên kết không gian như NOESY hay ROESY.
- Các
8C.3. Gán phổ NMR mẫu Quinine
- Dữ liệu thực nghiệm:
- Phổ 1H NMR
-
- Dữ liệu thực nghiệm:
-
- Giải phổ:
- Giải phổ:
Bước 1: Phân tích phổ 1H NMR
Phổ 1H NMR của chất được giả định là của Quinine
- Nhận xét
- Về bản chất, đây là bài toán gán phổ hay bài toán khẳng định chất.
- Trong ví dụ này, chúng ta sẽ ngạc nhiên vì bộ dữ liệu NMR không bao gồm một trong các dạng phổ NMR cơ bản nhất là phổ 13C NMR. Thay vào đó, thông tin cần rút ra từ phổ 13C NMR được khai thác từ phổ dạng C-H COSY, như HSQC, HMBC. Đây là xu hướng mới ở các nước NMR phát triển, nhằm khai thác những lợi thế vượt trội về kỹ thuật và sự phong phú thông tin phổ của phổ H-C COSY so với phổ 13C NMR truyền thống.
- Nhận xét
- Về bản chất, đây là bài toán gán phổ hay bài toán khẳng định chất.
- Trong ví dụ này, chúng ta sẽ ngạc nhiên vì bộ dữ liệu NMR không bao gồm một trong các dạng phổ NMR cơ bản nhất là phổ 13C NMR. Thay vào đó, thông tin cần rút ra từ phổ 13C NMR được khai thác từ phổ dạng C-H COSY, như HSQC, HMBC. Đây là xu hướng mới ở các nước NMR phát triển, nhằm khai thác những lợi thế vượt trội về kỹ thuật và sự phong phú thông tin phổ của phổ H-C COSY so với phổ 13C NMR truyền thống.
Bước 1: Phân tích phổ 1H NMR
 |
| Phổ 1H NMR của chất được giả định là của Quinine |
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét