14.1 Tổng quan về qNMR
- Lịch sử qNMR
Ý tưởng ứng dụng NMR trong phân tích định lượng (qNMR) do Solomon đề xuất tại hội thảo Liên hợp quốc về "Ứng dụng hòa bình của năng lượng Nguyên tử" (1958), tức là 12 năm sau khi ra đời NMR, được xem là một trong những đề xuất có tính hệ thống đầu tiên về qNMR, mặc dù có những nghiên cứu và công bố thăm dò về qNMR trong lĩnh vực hóa dược ra đời trước đó vài năm. Cũng như nhiều lĩnh vực ứng dụng NMR khác, qNMR sau đó đã "tăng tốc" nhanh chóng và ngày nay đã trở thành một nhánh ứng dụng quan trọng của NMR.
 |
| H1: Thống kê các công bố qNMR nói chung và qNMR cho nghiên cứu các hợp chất tự nhiên (NP) từ 1954 đến 2011 [Bruker]. |
Từ trước đến nay, phân tích định lượng thường được thực hiên bằng các phương pháp sắc ký (LC, GC), UV, MS, TGA hoặc kết hợp các phương pháp này với nhau. Thiết bị, quy trình, chất chuẩn, ... thường đã được chuẩn hóa thành các tiêu chuẩn quốc gia hoặc quốc tế.
qNMR có nhiều điểm giống nhau nhưng cũng có nhiều điểm khác nhau so với các phương pháp phân tích định lượng truyền thống nêu trên. Khác biệt chính là: Các phương pháp truyền thống phân tích định lượng dựa trên đặc trưng của phân tử (đối tượng chính cần phân tích), trong khi qNMR lại dựa trên đặc trưng của hạt nhân, của nguyên tử có trong thành phần phân tử cần phân tích. Ví dụ, khi phân tích Curcumin, sắc ký hay khối phổ phải dựa trên đặc trưng sắc ký của chính Curcumin, trong khi qNMR sẽ dựa trên đặc trưng từ của proton (1H) hay Carbon (13C) có trong thành phần cấu trúc của Curcumin. Điểm khác biệt cơ bản trên dẫn đến một số hệ quả như:
- Chất chuẩn qNMR không phải là chính chất cần phân tích,
- Khi phân tích qNMR không cần xây dựng đường chuẩn.
Như vậy có thể chỉ cần một số chất chuẩn qNMR nhất định dùng chung cho nhiều chất phân tích. Điều này rất quan trọng đối với các chất chuẩn quý hiếm, đắt tiền, nhất là các chất mới, chưa có chất chuẩn.
H2: So sánh phân tích định lượng truyền thống và qNMR
Mặc dù có ưu điểm so với các phương pháp truyền thống là phân tích nhanh (vài chục phút đến vài giờ) và không cần dựng đường chuẩn, chi phí thấp nhưng qNMR vẫn chủ yếu mới chỉ được xem là phương pháp phân tích định lượng thăm dò, hỗ trợ và tham khảo, chỉ rất ít nước hay tổ chức quốc tế đưa qNMR vào danh sách Công cụ định lượng chính quy. Hạn chế chính của qNMR là độ chính xác mới chỉ đạt xấp xỉ các phương pháp truyền thống, chỉ đủ đáp ứng yêu cầu của những đối tượng phân tích định lượng nhất định.
- Phân loại qNMR
Theo phương pháp sử dụng chất chuẩn, hiện tại, qNMR được chia thành 2 nhánh chính là qNMR nội chuẩn và qNMR ngoại chuẩn. Khác biệt chính giữa 2 kỹ thuật này là: qNMR nội chuẩn yêu cầu trộn chất chuẩn với chất phân tích, hoặc sử dụng ống đo NMR 2 lớp, lớp trong đựng chất chuẩn, lớp ngoài đựng chất đo, đo đồng thời chất chuẩn và chất phân tích trên cùng một phép đo phổ NMR, trong khi qNMR ngoại chuẩn đo riêng rẽ chất chuẩn và chất phân tích. Nói chung, qNMR nội chuẩn phức tạp hơn, độ chính xác cao hơn so với qNMR ngoại chuẩn.
H3: So sánh qNMR nội chuẩn và qNMR ngoại chuẩn
Theo mục đích phân tích, hiện tại qNMR được chia thành 02 nhánh chính là: Phân tích qNMR tuyệt đối và phân tích qNMR tương đối. Đích của phân tích tuyệt đối thường là xác định nồng độ, hàm lượng, độ sạch, trong khi đó đích của phân tích tương đối thường là tỷ lệ Mol (%) của các thành phần trong hỗn hợp (sản phẩm).
Một hướng mới trong phân tích qNMR là qNMR thống kê, kết hợp các công cụ thống kê đa biến (PCA, PLS-Da, ...) để đánh giá, phân loại các sản phẩm tự nhiên, thực phẩm, dược liệu, ... dựa trên phân bố các chất chuyển hóa (metabolomics).
- Quy trình qNMR
Về cơ bản, quy trình qNMR, cả nội chuẩn cũng như ngoại chuẩn, đều gồm 4 bước như mô tả ở phía phải H2. Riêng phần đo phổ NMR có những yêu cầu riêng so với NMR định tính, cụ thể là:
- Chọn dạng phổ, thường là phổ 1D-1H.
- Xác định giá trị thời gian hồi phục T1 của (các) tín hiệu 1H cần quan tâm (của cả chất chuẩn và chất phân tích), trên cơ sở đó chọn thời gian chờ (d1) sao cho đủ dài (cỡ 5-7 lần T1).
- Đo lặp lại, thường là 03 lần với mỗi phép đo.
- Duy trì thông số đo như nhau với mọi toàn bộ các phép đo, kể cả mẫu so sánh (ngoại chuẩn).
14.2 qNMR nội chuẩn
Từ trước đến nay, phân tích định lượng thường được thực hiên bằng các phương pháp sắc ký (LC, GC), UV, MS, TGA hoặc kết hợp các phương pháp này với nhau. Thiết bị, quy trình, chất chuẩn, ... thường đã được chuẩn hóa thành các tiêu chuẩn quốc gia hoặc quốc tế.
qNMR có nhiều điểm giống nhau nhưng cũng có nhiều điểm khác nhau so với các phương pháp phân tích định lượng truyền thống nêu trên. Khác biệt chính là: Các phương pháp truyền thống phân tích định lượng dựa trên đặc trưng của phân tử (đối tượng chính cần phân tích), trong khi qNMR lại dựa trên đặc trưng của hạt nhân, của nguyên tử có trong thành phần phân tử cần phân tích. Ví dụ, khi phân tích Curcumin, sắc ký hay khối phổ phải dựa trên đặc trưng sắc ký của chính Curcumin, trong khi qNMR sẽ dựa trên đặc trưng từ của proton (1H) hay Carbon (13C) có trong thành phần cấu trúc của Curcumin. Điểm khác biệt cơ bản trên dẫn đến một số hệ quả như:
- Chất chuẩn qNMR không phải là chính chất cần phân tích,
- Khi phân tích qNMR không cần xây dựng đường chuẩn.
Như vậy có thể chỉ cần một số chất chuẩn qNMR nhất định dùng chung cho nhiều chất phân tích. Điều này rất quan trọng đối với các chất chuẩn quý hiếm, đắt tiền, nhất là các chất mới, chưa có chất chuẩn.
Mặc dù có ưu điểm so với các phương pháp truyền thống là phân tích nhanh (vài chục phút đến vài giờ) và không cần dựng đường chuẩn, chi phí thấp nhưng qNMR vẫn chủ yếu mới chỉ được xem là phương pháp phân tích định lượng thăm dò, hỗ trợ và tham khảo, chỉ rất ít nước hay tổ chức quốc tế đưa qNMR vào danh sách Công cụ định lượng chính quy. Hạn chế chính của qNMR là độ chính xác mới chỉ đạt xấp xỉ các phương pháp truyền thống, chỉ đủ đáp ứng yêu cầu của những đối tượng phân tích định lượng nhất định.
- Chất chuẩn qNMR không phải là chính chất cần phân tích,
- Khi phân tích qNMR không cần xây dựng đường chuẩn.
Như vậy có thể chỉ cần một số chất chuẩn qNMR nhất định dùng chung cho nhiều chất phân tích. Điều này rất quan trọng đối với các chất chuẩn quý hiếm, đắt tiền, nhất là các chất mới, chưa có chất chuẩn.
 |
| H2: So sánh phân tích định lượng truyền thống và qNMR |
- Phân loại qNMR
Theo phương pháp sử dụng chất chuẩn, hiện tại, qNMR được chia thành 2 nhánh chính là qNMR nội chuẩn và qNMR ngoại chuẩn. Khác biệt chính giữa 2 kỹ thuật này là: qNMR nội chuẩn yêu cầu trộn chất chuẩn với chất phân tích, hoặc sử dụng ống đo NMR 2 lớp, lớp trong đựng chất chuẩn, lớp ngoài đựng chất đo, đo đồng thời chất chuẩn và chất phân tích trên cùng một phép đo phổ NMR, trong khi qNMR ngoại chuẩn đo riêng rẽ chất chuẩn và chất phân tích. Nói chung, qNMR nội chuẩn phức tạp hơn, độ chính xác cao hơn so với qNMR ngoại chuẩn.
 |
| H3: So sánh qNMR nội chuẩn và qNMR ngoại chuẩn |
Theo mục đích phân tích, hiện tại qNMR được chia thành 02 nhánh chính là: Phân tích qNMR tuyệt đối và phân tích qNMR tương đối. Đích của phân tích tuyệt đối thường là xác định nồng độ, hàm lượng, độ sạch, trong khi đó đích của phân tích tương đối thường là tỷ lệ Mol (%) của các thành phần trong hỗn hợp (sản phẩm).
Một hướng mới trong phân tích qNMR là qNMR thống kê, kết hợp các công cụ thống kê đa biến (PCA, PLS-Da, ...) để đánh giá, phân loại các sản phẩm tự nhiên, thực phẩm, dược liệu, ... dựa trên phân bố các chất chuyển hóa (metabolomics).
Về cơ bản, quy trình qNMR, cả nội chuẩn cũng như ngoại chuẩn, đều gồm 4 bước như mô tả ở phía phải H2. Riêng phần đo phổ NMR có những yêu cầu riêng so với NMR định tính, cụ thể là:
- Chọn dạng phổ, thường là phổ 1D-1H.
- Xác định giá trị thời gian hồi phục T1 của (các) tín hiệu 1H cần quan tâm (của cả chất chuẩn và chất phân tích), trên cơ sở đó chọn thời gian chờ (d1) sao cho đủ dài (cỡ 5-7 lần T1).
- Đo lặp lại, thường là 03 lần với mỗi phép đo.
- Duy trì thông số đo như nhau với mọi toàn bộ các phép đo, kể cả mẫu so sánh (ngoại chuẩn).
Một hướng mới trong phân tích qNMR là qNMR thống kê, kết hợp các công cụ thống kê đa biến (PCA, PLS-Da, ...) để đánh giá, phân loại các sản phẩm tự nhiên, thực phẩm, dược liệu, ... dựa trên phân bố các chất chuyển hóa (metabolomics).
- Quy trình qNMR
Về cơ bản, quy trình qNMR, cả nội chuẩn cũng như ngoại chuẩn, đều gồm 4 bước như mô tả ở phía phải H2. Riêng phần đo phổ NMR có những yêu cầu riêng so với NMR định tính, cụ thể là:
- Chọn dạng phổ, thường là phổ 1D-1H.
- Xác định giá trị thời gian hồi phục T1 của (các) tín hiệu 1H cần quan tâm (của cả chất chuẩn và chất phân tích), trên cơ sở đó chọn thời gian chờ (d1) sao cho đủ dài (cỡ 5-7 lần T1).
- Đo lặp lại, thường là 03 lần với mỗi phép đo.
- Duy trì thông số đo như nhau với mọi toàn bộ các phép đo, kể cả mẫu so sánh (ngoại chuẩn).
- Chất chuẩn trong qNMR
Giống như các phương pháp phân tích định lượng khác, qNMR đòi hỏi phải có chất chuẩn trừ một số trường hợp phân tích định lượng tương đối để xác định tỷ lệ phần trăm các chất thành phần trong một hỗn hợp. Trong khi chất chuẩn cho HPLC, MS rất phong phú thì chất chuẩn cho qNMR chỉ là một danh sách không dài, vài chục chất vì qNMR có thể dùng chất chuẩn chung cho nhiều chất, không nhất thiết phải là chuẩn của chính chất phân tích, miễn là đáp ứng một số tiêu chuẩn cho qNMR, như:
- Có độ sạch cao (tuyệt đối hoặc gần tuyệt đối);
- Không hút ẩm, không bay hơi, không lẫn nước;
- Hòa tan tốt trong các dung môi NMR (Deuterated Solvents);
- Có phổ 1H NMR tương đối đơn giản, rõ.
Việc chọn chất chuẩn nào cho mẫu hay họ mẫu dự định phân tích qNMR là tùy thuộc yêu cầu, loại mẫu, thiết bị NMR và phương pháp qNMR cụ thể sẽ áp dụng. Quan trọng nhất là mẫu chuẩn phải có thông tin định tính, định lượng đầy đủ.
H4: Một số chất chuẩn qNMR thông dụng và dung môi NMR tương ứng
Một số nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm sử dụng và đánh giá mẫu chuẩn là chính tín hiệu của dung môi NMR. Giải pháp này có tính tiện lợi và kinh tế cao.
- Ví dụ qNMR nội chuẩn
H5: Ví dụ minh hoah ứng dụng qNMR nội chuẩn
14.3 qNMR ngoại chuẩn
- Có độ sạch cao (tuyệt đối hoặc gần tuyệt đối);
- Không hút ẩm, không bay hơi, không lẫn nước;
- Hòa tan tốt trong các dung môi NMR (Deuterated Solvents);
- Có phổ 1H NMR tương đối đơn giản, rõ.
 |
| H4: Một số chất chuẩn qNMR thông dụng và dung môi NMR tương ứng |
- Ví dụ qNMR nội chuẩn
 |
| H5: Ví dụ minh hoah ứng dụng qNMR nội chuẩn |
- Phương pháp PULCON và ERETIC
qNMR ngoại chuẩn thường được thực hiện theo phương pháp Eretic (Electronic REference To access In vivo Concentration). Theo tên gọi thì Eretic sử dụng chuẩn số, chuẩn điện tử! Trên thực tế, Eretic vẫn cần có chất chuẩn như qNMR nội chuẩn, nhưng chất chuẩn được để riêng, đo phổ NMR riêng, sau đó "trộn" với phổ chất phân tích theo những thuật toán, quy tắc đặc biệt, vì vậy gọi là chuẩn điện tử (Electronic). qNMR theo Eretic dễ dàng và kinh tế hơn nhiều so với qNMR nội chuẩn: Chỉ cần đo phổ chất chuẩn một lần, dùng được cho nhiều lần, không phải tách chất chuẩn ra khỏi chất phân tích sau khi đo nếu muốn thu hồi mẫu.
Đã có nhiều nghiên cứu so sánh độ chính xác, độ lặp lại của Eretic so với các phương pháp định tính sắc ký cũng như qNMR nội chuẩn. Kết luận là Eretic qNMR có thể đạt yêu cầu xấp xỉ qNMR nội chuẩn.
- Ví dụ NMR ngoại chuẩn
H6: Xác định nồng độ Ethoxycinnamic Acid bằng phương pháp ngoại chuẩn qNMR (Eretic).
Hình trái: phổ chất chuẩn Dioxane; Hình phải: Phổ mẫu phân tích.
14.4 Ứng dụng qNMR
qNMR ngoại chuẩn thường được thực hiện theo phương pháp Eretic (Electronic REference To access In vivo Concentration). Theo tên gọi thì Eretic sử dụng chuẩn số, chuẩn điện tử! Trên thực tế, Eretic vẫn cần có chất chuẩn như qNMR nội chuẩn, nhưng chất chuẩn được để riêng, đo phổ NMR riêng, sau đó "trộn" với phổ chất phân tích theo những thuật toán, quy tắc đặc biệt, vì vậy gọi là chuẩn điện tử (Electronic). qNMR theo Eretic dễ dàng và kinh tế hơn nhiều so với qNMR nội chuẩn: Chỉ cần đo phổ chất chuẩn một lần, dùng được cho nhiều lần, không phải tách chất chuẩn ra khỏi chất phân tích sau khi đo nếu muốn thu hồi mẫu.
Đã có nhiều nghiên cứu so sánh độ chính xác, độ lặp lại của Eretic so với các phương pháp định tính sắc ký cũng như qNMR nội chuẩn. Kết luận là Eretic qNMR có thể đạt yêu cầu xấp xỉ qNMR nội chuẩn.
 |
| H6: Xác định nồng độ Ethoxycinnamic Acid bằng phương pháp ngoại chuẩn qNMR (Eretic). Hình trái: phổ chất chuẩn Dioxane; Hình phải: Phổ mẫu phân tích. |
- qNMR trong hóa dược
- Xác định nồng độ mol, độ sạch, hàm lượng hoạt chất (Potency) trong nguyên liệu dược (thực vật) và dược liệu, trong các bài thuốc đông y dân gian.
- Ví dụ:
- Ví dụ:
- qNMR trong hóa thực phẩm
- Xác định nồng độ mol, độ sạch, tỷ lệ thành phần nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm, dinh dưỡng.
- Ví dụ:
- Ví dụ:
- qNMR trong hóa học các hợp chất tự nhiên
- Xác định nồng độ mol, độ sạch, tỷ lệ thành phần dịch chiết thực động vật
- Ví dụ:
- Ví dụ:
- qNMR đánh giá các chất chuẩn phân tích
- Xác định nồng độ mol, độ sạch các chất chuẩn dùng trong phân tích định lượng truyền thống
- Ví dụ:
- Ví dụ:
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét