Sát thủ CCH

Bước quan trọng trong giải phổ chính là xác định khung cấu trúc, chủ yếu là xác định các liên kết C-H, trừ các phân tử quá nhỏ, rất đơn giản, nhìn lướt qua phổ đã xác định được cấu trúc, gán được phổ, không cần dựng khung. Khoảng 30 năm về trước, hai công cụ chính để xác định liên kết C-H là phổ HETCOR để xác định 1J(C-H) và phổ COLOC đối với 2J, 3J, thậm chí 4J. Sau này, phổ HETCOR và COLOC được thay thế tương ứng bằng 2 dạng phổ HMQC và HMBC là những phổ đo đảo có độ nhạy cao hơn nhiều. Gần đây, người ta có xu hướng thay thế phổ HMQC bằng kỹ thuật tương tự là phổ HSQC, vốn được dùng xác định liên kết N-H trong cấu trúc protein.

Thực tế giải phổ HMBC, chúng ta thường gặp câu hỏi: Một liên kết A trên phổ HMBC là 2J hay 3J. Các tín hiệu 2J và 3J hoặc là khó phân biệt với nhau,hoặc là cùng rất nhỏ, thậm chí không thấy. Nguồn gốc của những hạn chế trên là do phổ HMBC dựa trên độ lớn 2J (H-C) và 3J (H-C) mà giá trị của chúng thường khác nhau không nhiều hoặc cùng rất nhỏ. Thực tế, tham số đo phổ HMBC thường được chọn tối ưu với J (C-H) cỡ 10Hz, do vậy các tín hiệu ứng với J(C-H) cỡ vài Hz rất dễ bị yếu hoặc mất trên phổ.

Giải pháp khắc phục các điểm trên chính là phổ H2BC, ra đời cách đây hơn chục năm (J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6154).

Phổ H2BC là một dạng phổ liên kết xa dựa trên liên kết H-...-H, cụ thể là 3J (H-C-C-H). Chính vì vậy, phổ H2BC còn có tên gọi là phổ HSQC-COSY. Độ lớn tín hiệu H2BC, vì thế không phụ thuộc độ lớn 2J(C-C-H) như phổ HMBC, mà phụ thuộc 3J(H-C-C-H). Hạn chế của thiết kế H2BC là trên phổ H2BC không xác định được các vị trí C bậc 4.

Mặc dù H2BC được đề xuất từ năm 2005 và được cộng đồng NMR đưa vào sử dụng ngay sau đó không lâu, nhưng vì nhiều lý do nên hiện tại phổ H2BC còn chưa được sử dụng rộng rãi, thậm chí ở Việt Nam, nhiều người thường tiếp xúc với NMR vẫn còn chưa biết đến H2BC!
   

Ví dụ 1: Phổ H2BC mẫu Sucrose

Thay vì liên kết C5'-H5' ở 82-3,9ppm (màu hồng), trên phổ H2BC sẽ xuất hiện 2 pic C5'-H4' và C5'-H6' (xanh), đều là 2J (CCH). Với phổ HMBC, ngoài 2 píc H2BC kể trên, chúng ta sẽ có thể có thêm các liên kết khác của C5', cùng nằm trên đường ngang 82ppm, do vậy phải làm sao xác định được đâu là 2J, đâu là 3J, 4J.

Phổ H2BC mẫu Sucrose.

Ví dụ 2: Phổ EdH2BC mẫu Prednisolon

Phổ EdH2BC là phiên bản ghép H2BC với DEPT, giống như phổ EdHSQC là phổ HSQCghép với phổ DEPT. Phổ H2BC chuẩn không phân biệt được các dạng CH, CH2 và CH3 nhưng phổ DEPT cho phép phân biệt CH2 với CH/CH3 nên phổ ghép EdH2BC cũng cho phép phân biệt CH2 với CH/CH3 theo kiểu DEPT135. Thường sự phân biệt trên được thể hiện bằng màu của tín hiệu.

Ví dụ phân tích chi tiết các liên kết ở lân cận 30ppm của phổ EdH2BC mẫu prednisolon (phần kẻ chấm chấm trong hình bên dưới). Với C ở vị trí thấp hơn, trên phổ có 02 tín hiệu màu đỏ, chứng tỏ đây là CH2 (C6). Còn C ở vị trí sát trên có 4 tín hiệu màu xanh, là CH hoặc CH3 (C8). 

Phổ H2BC chuẩn (bên trái) và phổ ghép EdH2BC (bên phải) mẫu prednisolon